IMF: OJ 1 2 16 19 In vitro Studien zur Entwicklung einer Pathogene-basierten Substitutionstherapie bei Netherton Syndrom (IMF CRISPR/Cas9)

Basic data for this project

Description

Das Netherton Syndrom (NTS) ist eine sehr belastende und seltene Hauterkrankung, die ab dem frühen Kleinkindalter auftritt. Verantwortlich sind Mutationen im Gen SPINK5, die in der Haut zu einem Mangel des multifunktionalen Protease-Inhibitors LEKTI führen. Der Bedarf für die Entwicklung einer spezifischen Therapie ist sehr hoch. Eine lokale Protein-Ersatztherapie mit dem full length LEKTI (145 kDa) ist problematisch. Möglich erscheint es, kleinere LEKTI-Einheiten zu exprimieren, um einen Transport durch das Stratum corneum zu erreichen, wobei unklar ist, welche Domäne/n hierfür geeignet wäre/n. Unser Projekt soll insbesondere diese Frage beantworten und ein in vitro Testsystem anhand von 3D Hautmodellen etablieren. Fragestellungen: Können einzelne LEKTI-Domänen den Ausfall anderer Domänen kompensieren? Wie ändern sich die Protease-Aktivität und das Expressionsmuster inflammatorischer Zytokine beim Wegfall einzelner Domänen? Wir haben herausgefunden, dass LEKTI einzelne Proteinsequenzen enthält, die als Konsensus-Sequenzen für Transglutaminasen fungieren könnten: Ist LEKTI tatsächlich Substrat der Transglutaminase/n - TGase-1, -3 oder andere? Welche Bedeutung hätte dieser funktionelle Zusammenhang? Methoden: Wir beabsichtigen die rekombinante Expression der Domänen D6, D7 sowie D8-9 im Baculovirus-Expressionssystem und deren Verwendung im fluoreszenzspektrometrischen und histochemischen TGase Assay. Die Relevanz einzelner Domänen soll durch gezielte Deletionsexperimente untersucht werden, für die wir die CRISPR/Cas9-Technologie einsetzen werden (Deletion von D6, D8-11 und D15). Als read out fungieren dreidimensionale (3D) Hautäquivalente und Expressionsstudien an primären Keratinozyten (Immunhistochemie, qRT-PCR-Experimente, Westernblotanalysen). Ausblick: Eine Schlüsselpublikation und die Etablierung des in vitro Testsystems anhand der 3D Hautmodelle soll in ein DFG-Projekt zur Proteinsubstitutionstherapie bei NTS münden.