FOR 2848: Architektur und Heterogenität der inneren mitochondrialen Membran auf der Nanoskala - TP 03: Heterogenität bei der protonen-basierten Energiekopplung

Grunddaten zu diesem Projekt

Beschreibung

Ziel dieses Projekts ist es, Ursprung und Wirkung der Protonenmotorischen Kraft PMF besser zu verstehen. Dieses Thema ist hochaktuell im Zusammenhang mit der Heterogenität der Mitochondrien, der Beseitigung von dysfunktionalen Mitochondrien-Abschnitten und der Frage nach der Bedeutung einzelner Cristae als Mikrokompartimente. Wir möchten konkret folgende Fragen untersuchen: Ist die laterale PMF entlang der inneren Membran an allen Stellen gleich (i), ist die Transmembran-Protonenmotorische Kraft an allen Stellen gleich (ii), ist die PMF im Fließgleichgewicht an den verschiedenen Protonenpumpen unterschiedlich (iii), und welchen Einfluss hat die Ultrastruktur der Innenmembran sowie die Mikrokompartmentierung von Proteinkomplexen auf die lokale Protonenkonzentration (iv)?Um dies zu untersuchen, werden wir eine detaillierte pH-Karte für die verschiedenen strukturellen und funktionellen Bereiche der mitochondrialen Innenmembran unter Verwendung hochempfindlicher, genetisch kodierter pH-Sensoren, die in unserem Labor bereits erfolgreich genutzt werden, erstellen. Von besonderem Interesse ist es, ob sich die die peripheren Intermembranräume, Cristae-Junctions und Cristae-Domänen mit ausgeprägter Membrankrümmung unterscheiden. Zur Bestimmung des pH-Wertes wird das pH-sensitive GFP-Derivat superecliptic pHluorin mit Proteinen fusioniert, die bestimmten Kompartimenten zugeordnet werden können. Für die simultane pH-Bestimmung auf der n-Seite werden wir spezifische HaloTag-Fusionsproteine generieren, die mit pH-sensitivem SNARF-1HTL posttranslational gefärbt werden. Zu den Kompartiment-spezifischen Kandidaten für lokale pH Messung gehören Untereinheiten der inneren Membranprotein-Importmaschinerie TIM, des MICOS-Komplexes (Cristae-Junctions) und der OXPHOS-Komplexe (Cristae-Lumen und Matrixraum). Die erhaltenen pH-Profile der Innenmembran werden mit dem Lokalisierungsprofil von OXPHOS-Komplexen korreliert, die durch Einzelmolekül-Tracking und Lokalisationsmikroskopie erhalten werden. Ein wichtiger Gesichtspunkt wird sein, zu verstehen, wie sich Veränderungen der Membranarchitektur auf die pH-Profile verschiedener innerer Membranregionen und letztlich auf die bioenergetische Funktion auswirken. Wir sind überzeugt, dass die in diesem Forschungsverbund zusammengeschlossene Gruppe von Spezialisten dieses Projekt nicht nur von verschiedenen Seiten unterstützen wird, sondern dass ihre Expertise für den Fortschritt unerlässlich ist: Um die Auswirkungen einer defekten OXPHOS-Organisation auf den PMF und die Funktionalität zu entschlüsseln, werden wir eng mit P. Rehling und S. Jakobs zusammenarbeiten. Bioenergetische Konsequenzen von Cristae-Junction-Veränderungen in MICOS-Mutanten werden zusammen mit M. Meinecke analysiert. In Zusammenarbeit mit K. Winklhofer werden wir OXPHOS/PMF-Änderungen in NFBkappab-vermittelten Stressreaktionen untersuchen. Zusammen mit O. Daumke werden wir die Bedeutung von OPA1 für die Aufrechterhaltung der PMF untersuchen.