SPP 1926 - Teilprojekt: Kontrolle über mRNA-Translation durch Licht-vermittelte Entschützung von synthetischen 5' - Kappen kombiniert mit Fluoreszenzmarkierung von mRNAs für in vivo-Anwendungen

Grunddaten zu diesem Projekt

Beschreibung

Die präzise räumliche und zeitliche Kontrolle der Genexpression ist entscheidend für die frühe Embryonalentwicklung. In streng koordinierter Weise laufen zeitgleich zahlreiche Prozesse ab, die für das Zellschicksal und die Zellmigration verantwortlich sind. Der Zebrafisch ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung der Wirbeltierentwicklung, da die Embryos durchsichtig sind und sich außerhalb des Mutterleibs entwickeln, wodurch sie gut zugänglich für mikroskopische Untersuchungen sind. Allerdings erreicht das aktuelle Methodenspektrum zur experimentellen Manipulation der Genexpression nicht die zeitliche und räumliche Kontrolle, um Faktoren zur Steuerung der Zellmigration (z.B. die Wanderung der Keimzellen) oder schnelle und subzelluläre Prozesse (z.B. RNA-Lokalisierung) zu untersuchen.Ebenso würde die Markierung von mRNA-Molekülen zur Untersuchung ihrer Dynamik von Markierungsmethoden profitieren, die die (bio)-chemischen und physikalischen Eigenschaften der Nukleinsäure nur minimal beeinflussen. Dies gilt insbesondere für bestimmte Sequenzen in der 3΄-UTR, die an der Regulation der Genexpression beteiligt sind. Wir haben einen neuen Ansatz entwickelt, mit dem wir mRNAs im poly(A)-Schwanz mit mehreren Fluorophoren markieren können, ohne die Primärsequenz der mRNA zu verändern. Wir konnten zeigen, dass wir diese mRNAs nach der Injektion in befruchtete Zebrafischeier im Ein-Zell-Stadium im sich entwickelnden Embryo verfolgen können und dass sie sich wie die entsprechenden nativen mRNAs verhalten.Im Rahmen dieses Projektes möchten wir nun ausgewählte mRNAs, die das Zellschicksal im sich entwickelnden Embryo beeinflussen, verfolgen und darüber hinaus ihre Translation durch Licht aktivieren. Um dies zu erreichen, haben wir einen Ansatz entwickelt, mit dem wir mRNAs enzymatisch an der 5΄-Kappe mit einer Photoschutzgruppe versehen können. Wir konnten zeigen, dass diese Modifikation die Translation blockiert und mit Hilfe von Licht abgespalten werden kann. Darauf aufbauend planen wir nun die Synthese und Charakterisierung weiterer photogeschützter 5΄-Kappen.Die entsprechenden photogeschützten mRNAs werden im Zebrafisch eingesetzt. Ziel ist es auf molekularer Ebene zu verstehen, wie die Freisetzung von Signalstoffen (Chemokinen) mit definierter räumlicher und zeitlicher Kontrolle die Migration von Keimzellen im Zebrafisch (als in vivo-Modell) dirigiert. Darüber hinaus werden wir die photogeschützten 5΄-Kappen und die mRNA-Markierung am poly(A)-Schwanz kombinieren, um für ausgewählte mRNAs herauszuarbeiten, welche Funktionen der mRNA und welche dem kodierten Protein zuzuschreiben sind. Hierfür werden wir die mRNAs, die für die Proteine Dead end, Nanos und Vasa kodieren, hinsichtlich ihrer Lokalisation untersuchen und – durch Licht-induzierte Translation zu verschiedenen Zeitpunkten – den Effekt der Expression auf verschiedene Entwicklungsstadien von Mutanten untersuchen.