Mechanismus und Regulation der RNA-Entwindung durch DEAD-Box RNA-Helikasen

Grunddaten zu diesem Projekt

Beschreibung

RNA-Helikasen katalysieren die ATP-abhängige Entwindung doppelsträngiger RNA in nahezu allen Prozessen des RNA-Metabolismus. Fehlfunktionen führen zur Entstehung von Krankheiten. DEAD-Box-Helikasen bestehen aus einem konservierten Helikase-Modul, das in einen nukleotidgesteuertern Konformationszyklus zwischen Zuständen hoher und geringer RNA-Affinität wechselt, und so eine basale Entwindungsaktivität vermittelt. Diese kann durch flankierende Regionen reguliert werden, die über bisher wenig verstandene Mechanismen an Nukleotidbindung und -hydrolyse, RNA-Bindung und Duplex-Entwindung mitwirken können Der Translationsinitiationsfaktor eIF4A ist eine minimale DEAD-Box-Helikase, die nur aus einem Helikase-Modul besteht. Seine Aktivität wird durch eine Vielzahl anderer Translationsfaktoren reguliert, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Im vorgeschlagenen Projekt werden wir die Regulation des Helikase-Mechanismus durch flankierende Regionen und durch Interaktionspartner untersuchen. Die funktionelle Kooperation von RNA-Bindungsdomänen (RBDs) mit dem Helikase-Modul werden wir am Beispiel der DEAD-Box-Helikasen YxiN (B. subtilis) und Hera (T. thermophilus) untersuchen, in denen eine C-terminale RBD an RNA bindet, und benachbarte Helizes dem Helikase-Modul zur Entwindung präsentiert. YxiN bindet spezifisch an ribosomale RNA, wohingegen Hera unspezifisch an strukturierte Regionen bindet. Wie werden die Bewegung der RBD im Nukleotidzyklus relativ zum Helikase-Modul mittels Einzelmolekül-FRET verfolgen, und den Pfad der RNA von der RBD zum Ort der Entwindung mittels Bindungsstudien an Varianten definieren. Weiterhin werden wie den Mechanismus der Entwindung und die in vivo Funktion von Hera untersuchen. Den funktionellen Kontext von Hera in Thermus werden wir definieren, indem wir Interaktionspartner mittels Deep sequencing (RNA) und Massenspektrometrie (Proteine) ermitteln. Eine mögliche Funktion von Hera als Kälteschockprotein werden wir direkt testen. Hera ist die einzige dimere DEAD-Box-Helikase. Wir werden die funktionelle Kooperation der beiden Helikase-Module im Hera-Dimer während der RNA-Entwindung mittels Einzelmolekül-FRET untersuchen. Um die Mechanismen der eIF4A-Regulation zu entschlüsseln, werden wir den Einfluss anderer Translationsinitiationsfaktoren auf die Kinetik der eIF4A-Konformationsänderungen mittels Einzelmolekül-FRET-TIRF-Mikroskopie bestimmen. Langfristig werden wir in einem in vitro Translationssystem mittels Einzelmolekül-FRET die molekulare Grundlage der Regulation von eIF4A und anderen Helikasen in der Initiation der Translation untersuchen.Insgesamt werden diese Arbeiten die Prinzipien der Regulation von Helikase-Modulen durch flankierende Regionen, Dimerisierung und durch Wechselwirkungspartner entschlüsseln und aufzeigen, wie diese funktionelle Einheit auf diese Weise optimal auf ihre zelluläre Funktion zugeschnitten werden kann.