Mechanistische Unterschiede der DNA-Relaxierung und Dekatenierung durch die Topoisomerasen II und VI

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Beschreibung

Topoisomerasen sind Enzyme, die verschiedene DNA-Topoisomere ineinander umwandeln. Sie superspiralisieren oder relaxieren, katenieren und dekatenieren oder verknoten und entknoten DNA. Dazu müssen sie einen oder beide Stränge ihres DNA-Substrats spalten. Typ II Topoisomerasen spalten beide Stränge der DNA und nutzen einen Strangdurchtrittsmechanismus, in dem eine DNA-Duplex (G-Segment) gebunden und gespalten wird. Durch das koordinierte Öffnen und Schließen transienter Protein-Protein-Kontaktflächen (Tore) wird dann eine weitere Duplex (T-Segment) durch die Lücke in der ersten transportiert. Das G-Segment wird am Ende wieder verknüpft. Die Typ IIA Topoisomerase Topo II und die Typ IIB Toposiomerase Topo VI katalysieren beide die ATP-abhängige Relaxierung sowie die Dekatenierung von DNA. Sie unterscheide sich aber in ihrer Struktur: Während Topo II ein Dimer mit drei Toren bildet, das N-Tor, das DNA-Tor, und das C-Tor, hat die heterotetramere Topo VI nur ein N- und ein DNA-Tor, aber kein C-Tor. Die strukturellen Unterschiede lassen Unterschiede in den zugrunde liegenden Mechanismen beider Enzyme vermuten. Diese Unterschiede sowie mögliche Unterschiede im Mechanismus der Relaxierungs- und Dekatenierungs-reaktion sind bisher unbekannt. In unseren bisherigen Arbeiten an den bakteriellen Enzymen Gyrase und Topo IV sowie in proof-of-principle Experimenten mit Topo II und Topo VI haben wir zahlreiche Werkzeuge entwickelt, um den Mechanismus der Superspiralisierung, Relaxierung und Dekatenierung durch Typ II Topoisomerasen umfassend zu untersuchen. Aufbauend auf dieser Ressource werden wir die Mechanismen von Topo II und Topo VI analysieren, um Gemeinsamkeiten und Unterschiede zu identifizieren. In Einzelmolekül-FRET-Experimenten werden wir die Konformationsänderungen beider Enzyme sowohl während der Relaxierung als auch der Dekatenierung von DNA untersuchen. Mit einem Fokus auf dem Öffnen und Schließen der Tore werden wir die ATP- und DNA-induzierten Konformationsänderungen bestimmen. Dabei werden wir den Effekt jedes der beiden ATP-Bindungs- und Hydrolyse-Ereignisse sowie beider DNA-Spaltungsereignisse aufschlüsseln. Wir werden die Stabilität der Tore und damit die Wahrscheinlichkeit ihres Öffnens sowie die auslösenden Ereignisse hierfür ermitteln. Weiterhin werden wir Einzelmolekül-FRET einsetzen, um symmetrische und asymmetrische Konformations-änderungen jenseits des Öffnens und Schließens der Tore zu bestimmen. Schließlich werden wir die zeitliche Koordination der einzelnen Konformationsänderungen entschlüsseln. Mit diesen Arbeiten werden die mechanistischen Unterschiede (1) der DNA-Relaxierung durch Topo II und Topo VI, (2) der Dekatenierungsreaktion beider Enzyme sowie (3) der Relaxierung und Dekatenierung für beide Enzyme ermitteln. Damit werden wir die Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen dem Zwei-Tor- und dem Drei-Tor-Mechanismus von Topo II und Topo VI entschlüsseln.